“基因魔剪”再升级 升级版可删除大段DNA

随着CRISPR-Cas技术的问世，人类改造、编辑生物基因密码的脚步大大加快。有了这把趁手的“基因魔剪”，人类可以对基因进行高效地定点编辑。

然而，主流的Cas9和Cas12a酶似乎更擅长单个碱基的定点编辑，在进行大规模删除DNA的时候显得“力不从心”。不过10月19日，美国研究人员在《自然·方法》发表论文称，他们开发出一种紧凑型级联CRISPR-Cas3系统，可快速准确地对大规模DNA片段进行删除。

传统“魔剪”只能“剪”小片段DNA

CRISPR-Cas系统的类型众多，目前研究最深入应用最成熟的就是CRISPR-Cas9系统。CRISPR-Cas9的结构简单，能够很容易地进入任何细胞，并精确地作用于DNA。只需要用目标遗传密码序列对它进行编程，这一工具便能够扫描整个DNA链，找到对应部分的基因，在适当的位置将这段DNA“剪”开。

“CRISPR-Cas9系统非常适合在明确或者校正某一个基因功能突变的时候，对单个基因进行剪辑或者小片段进行修改。”南开大学生命科学学院副院长陈凌懿教授介绍，虽然Cas9可以在需要的地方进行剪切，但是只能剪一刀，因此想删除整个基因位点特别大的DNA片段时，就存在一定局限性。

“就像拆迁房子，如果小区里只有一幢危楼，那么只需要对这幢危楼进行维修或者拆除重建;但是如果要平整土地，或者拆除修补危楼的时候，那就要拆除更多的房子，破坏整个小区环境了。”陈凌懿说，拆迁一幢楼不可能大刀阔斧，但是拆迁很多房子就需要更高效的工具了。

陈凌懿进一步解释说：“最近发现，Cas9产生的‘基因敲除’，通常通过在编码基因的开放阅读框中引入小的插入或删除突变而导致移码突变，这种方法适用于编码蛋白质的mRNA(信使RNA)。移码突变是指，3个核苷酸密码编码一个氨基酸，当删除的核苷酸数不是3的整数倍时，就会导致编码顺序发生错位而出现的突变。然而，对非编码RNA，因为其并不编码蛋白质，所以不存在移码突变。此时，就需要采取全基因去除的方法。而哺乳动物的基因，一个基因可能很大，包括外显子和内含子，当几个外显子相距比较远的时候，如果想完整删除，就需要删除很大片段DNA。”

对于真核细胞来说，可大片段删除DNA的工具将促进对大部分非编码基因片段的询问，提高对大部分未知功能的编辑效率，它因此将成为一个强大的基因筛选工具。

升级版能“吃掉”大片段DNA

作为“基因魔剪”的CRISPR系统是如何工作的呢?

陈凌懿介绍，CRISPR系统主要由相关核酸酶(Cas9)和向导RNA(gRNA)组成。gRNA能识别出外来侵略者的特定核酸序列，在碱基配对成功后，Cas9蛋白会使识别位点的DNA双链断裂。随后生物体自身存在着DNA损伤修复的应答机制，会将断裂上下游两端的序列连接起来，大多数时候这种连接会引入片段或删除突变，从而实现了细胞中目标基因的敲除。如果在此基础上为细胞引入一个修复的“模板”(供体DNA分子)，这样细胞就会按照提供的模板在修复过程中引入片段插入或定点突变，以此实现基因的替换或者突变。

此次“升级版”新系统，称为 CRISPR-Cas3系统，是由进行性核酸酶Cas3和其他成分组成的最小版本。该Cas3系统可用来切断DNA片段，删除长段DNA。而且它的精度很高，是少有的高质量大规模编辑工具。Cas3系统只需要4个蛋白和1个crRNA，CRISPR-Cas9系统却需要6个蛋白和1个crRNA，而在基因编辑时，需要将此系统导入到目标细胞中，系统越小，越容易操作。Cas3作为最小的CRISPR系统的一部分，兼具准确性和可变性，已在铜绿假单胞菌中高效地完成了碱基对数量高达424kb的基因组删除。

“与Cas9剪一刀就完成任务不同，Cas3系统不仅像一把剪刀，还像‘吃豆人’游戏里的‘大嘴巴’。”陈凌懿介绍，Cas3系统找到特定的DNA靶标后，可以先像Cas9一样剪断DNA双链，但是和Cas9不同，Cas3将停留在DNA断点处继续吞食DNA，很快就能“吃掉”一大段，最终造成大片段DNA的删除。

“之所以可以变身‘吃豆人’，与Cas3的DNA酶特性有关，其亚单位比Cas9多一些，有结构可以结合到DNA上。”陈凌懿解释说，就相当于只有抓住绳子末端，才可以沿着绳子往前走。虽然Cas3和Cas9识别DNA特异序列的方式是一样的，但是识别之后，剪切的方式是不一样的。Cas3系统既有手的功能，能锚定在DNA的位点上，同时又有“吃豆人”的功能，不断把DNA“吃”下去。

未来在工业发酵领域应用价值大

CRISPR系统目前主要应用于肿瘤、遗传等疾病的治疗方面。此次CRISPR-Cas3系统的出现，其高效率和高精度是否能让CRISPR系统的应用更加广阔?

“在CRISPR-Cas9系统中存在的脱靶效应，在大片段删除系统中同样存在这样的风险。而且大片段删除还增加另一个风险，就是可否准确地控制删除的长度。”陈凌懿对CRISPR-Cas3系统删除基因的精准性提出了质疑。科学家在实验室可以筛选出准确删除目标基因的细胞;但是在临床应用中，可能会面临更多的问题和挑战。另外，目前的工作只证明了CRISPR-Cas3系统在细菌中起作用，能否在高等生物特别是哺乳动物中应用CRISPR-Cas3系统进行大片段DNA的删除，还有待证明。

“此外，在临床上，患者进行治疗时，我们检测到某一个基因突变了，要定点把突变基因修复，这需要进行精准编辑。”陈凌懿认为，如果大片段删除基因，就是一种大规模的破坏性治疗，不符合临床小规模、小修复的治疗原则，这种案例非常少见。而且以目前我们对编码或是非编码基因的了解，大片段删除或引入还有很多未知数，因此很可能病没治好，反而增添了新病。

“虽然说目前应用于临床还有一定难度，但CRISPR-Cas3还可以在工业、农业中发挥作用。”陈凌懿表示，比如工业发酵，所使用的菌种基因组越大，整个发酵过程中真正合成目标产物就越低效。“因此在进行工业发酵的时候，我们选择菌种希望越简单越好，除了菌种存活所必需的基因外，最好就一个酶。”陈凌懿说，把系统简化的时候相当于把菌种里不需要的基因去掉，在最小基因组的细菌当中，引入新的基因。这种做减法的过程就可以使用CRISPR-Cas3系统进行大片段删除来完成。如果DNA删多了，菌种可能就死掉了，只有删得合适了，才能得到基因组被简化的活菌种。